投喂氟苯尼考后黄颡鱼肠道内细菌耐药性的变化

摘要

对平均体重（22.0±5.0）g的黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）连续投喂含有25.0mg/kg.鱼体重氟苯尼考的颗粒饲料5d后，从每尾试验黄颡鱼肠道中分离10个菌株，分别对这些分离菌株进行药物敏感性测定，比较了用药前后分离菌株对各种抗菌素药物感受性的变化。结果表明，与未投喂药物的对照黄顙鱼相比，从投喂氟苯尼考黄颡鱼的消化道中分离的细菌，对同属于酰胺醇类的氟苯尼考和甲砜霉素的耐药性明显增加，而对不属于酰胺醇类的硫酸新霉素、盐酸多西环素和恩诺沙星的感受性则没有明显影响。

关键词 黄颡鱼；氟苯尼考；药敏实验；耐药率

对人工养殖黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）的细菌性疾病，主要依靠各种抗菌素类药物治疗[1]。但是，抗菌素的使用容易导致细菌产生耐药性，而且细菌对不同抗菌素耐药性的产生强弱与速率，可能因细菌的种类和抗菌素使用频率有关[2]。了解抗菌素使用后鱼类消化道中细菌耐药性的变化，对于将抗菌素作为水产用兽药时制定科学用药程序是具有重要参考作用的。

本研究将氟苯尼考添加在饲料中连续投喂黄颡鱼5 d后，从供试黄颡鱼消化道中分离细菌，测定了这些细菌在用药前后的对部分渔用抗菌素药物感受性变化。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 供试药物

本次试验中用于投喂黄颡鱼的药物是 武汉欣欣佳丽生物科技有限公司生产的 属于酰胺醇类的氟苯尼考（Florfenicol） 、 用于测定分离菌株药物感受的药物包括属于酰胺醇类的甲砜霉素（Thiamphenicol） 、 属于氨基糖苷类的硫酸新霉素（Neomycin Sulfate） 、 属于四环素类的盐酸多西环素（Doxycycline Hcl） 、 属于喹诺酮类的恩诺沙星（Enrofloxacin）。

1.2 试验鱼及其饲养条件

本研究中的黄颡鱼由盐城裕达水产养殖公司提供。选择健康、活泼无外伤的黄颡鱼作试验鱼。在每个2.0m×2.0m×1.6m的网箱（图1）中饲养50尾平均体重为（22.0±5.0）g的黄颡鱼，每天投喂相当于鱼体重1.5%的人工配合饲料（盐城裕达饲料有限公司生产的黄颡鱼专用配合饲料）。驯养10 d，待供试黄颡鱼适应环境，并确认无疾病症状后，开始试验。试验期间池塘中日均换水量约20.0%左右。饲养水温变化幅度为（21±3）℃。

图1 设置在水泥池中的饲养网箱

1.3 药物饵料的制备与投喂

将氟苯尼考按25.0mg/kg.鱼体重的用药量，将药物首先均匀地拌和在熟化的淀粉糊（图2）中，再均匀地拌合在颗粒饲料中制作成药饵（图3）。添加药物的饵料投喂3个网箱中的黄颡鱼，作为试验组；以未添加药物的饵料喂养1个网箱中的黄颡鱼，作为对照组。每天投喂1次药饵，连续投喂5 d。停止投喂药物饵料1d后，从供试鱼消化道中采样。

图2 熟化淀粉糊

图3 拌合药物饲料

1.4 细菌分离

在投喂药物饵料结束后的第2 d，从每个试验和对照网箱中各随机捞取5尾黄颡鱼，在无菌条件下，将供试鱼体用酒精消毒后解剖，从其肠道中采样并接种在铺有脑心浸液琼脂培养基（BHIA，Difco）的平板上，从每尾鱼消化道中分离的细菌接种3个平板。将接种后的平板置于25℃恒温培养箱中培养48 h后，从每尾鱼肠道中接种的3个平板中，共随机挑取10个菌落，从3个试验组黄颡鱼消化道中共分离150个菌株，对照组黄颡鱼消化道中共分离50个菌株。分别转接在BHIA平板中，在25℃恒温培养箱中进行分离菌株的纯培养。培养48 h后，用灭菌生理盐水洗下平板中的菌落，并调节细菌浓度为106cfu/mL，冷藏备用。

1.5 最小抑菌浓度（MIC）的测定

依日本化学疗法学会的方法进行[3]。首先将各种抗菌药物以适宜溶媒溶解后，再用灭菌生理盐水分别稀释至1000.0mg/L的浓度。然后在无菌条件下，用灭菌后的脑心浸液培养基（BHI，Difco）将药物稀释10倍，从而使培养基中药物的浓度达到100.0mg/L的浓度。再用定量移液枪向每支盛有2.9 mL BHI培养基的试管中加入2.9 mL含有药物的培养基，将试管在混悬器上混合均匀后，从中吸取2.9 mL含有药物的BHI培养基加到下一试管中，以此类推制作成药物浓度分别为100.0mg/L、50.0mg/L、25.0mg/L……0.025mg/L的2倍稀释药物系列培养基试管。最后，定量吸取0.1mL浓度约为1.2×106cfu/mL活菌液（比浊法测定）加入上述每支试管中，摇匀。置于25℃条件下培养72 h，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.5 最小杀菌浓度（MBC）的测定

从各种药物的MIC浓度以及高于MIC浓度的试管中分别取0.1mL培养液，接种于BHIA（Difco）培养基平皿中，置36℃条件下培养5 d，没有菌落出现的相应试管中的最低药物浓度，即判为这种药物的最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentrations，MBC）。

2 结果

2.1 用药前后菌株MIC的变化

从试验和对照黄颡鱼消化道中分离菌株对各种抗菌药物的MIC测定结果如表1所示。

表1 用药前后黄颡鱼消化道中细菌对各种药物最小抑菌浓度（MIC）变化

由表1可以看出，氟苯尼考对从对照组黄颡鱼消化道中分离的50个菌株的MIC分别为0.05~0.78µg/mL，从连续投喂5 d氟苯尼考药物饵料后的黄颡鱼消化道中分离的150个菌株，其MIC上升至0.39~6.25µg/mL。对属于同一类的甲砜霉素，对照组黄颡鱼消化道中分离的50个菌株的MIC为0.05~0.78µg/mL，而对从试验组黄颡鱼消化道中分离的150个菌株的MIC上升0.10~3.13µg/mL。硫酸新霉素、盐酸多西环素和恩诺沙星等3种抗菌药物，无论是对从试验还是对照组黄颡鱼消化道中分离菌株的MIC均没有明显变化。

2.1 用药前后菌株MBC的变化

从试验和对照黄颡鱼消化道中分离菌株对各种抗菌药物的MBC测定结果如表2所示。

表2 用药前后黄颡鱼消化道中细菌对各种药物最小杀菌浓度（MBC）变化

由表2可以看出，氟苯尼考对从对照组黄颡鱼消化道中分离的50个菌株的MBC分别为3.13~6.25µg/mL，从连续投喂5 d氟苯尼考药物饵料后的黄颡鱼消化道中分离的150个菌株，其MBC上升至3.13~12.5µg/mL。对属于同一类的甲砜霉素，对照组黄颡鱼消化道中分离的50个菌株的MBC为1.56~6.25µg/mL，而对从试验组黄颡鱼消化道中分离的150个菌株的MBC上升3.13~12.5µg/mL。硫酸新霉素对试验和对照黄颡鱼消化道中分离菌株的MBC均为3.13~25.0µg/mL；盐酸多西环素的MBC为6.25~50.0µg/mL；恩诺沙星等的MBC均为12.5~100.0µg/mL。即无论是对从试验还是对照组黄颡鱼消化道中分离菌株的MBC均没有明显变化。

3 讨论

已经有研究结果证明，对鱼类使用抗菌素与对其他动植物使用抗菌素一样，容易导致致病菌产生耐药性[4~12]。本研究中经过连续5d给黄颡鱼投喂氟苯尼考药物饵料后，从试验鱼消化道中分离的菌株，至少是大部分菌株已经对该药物的耐药性明显增强。说明给鱼类投喂氟苯尼考容易导致养殖鱼类消化道内的细菌产生耐药性。

细菌对不同抗菌素的敏感性是不同的[8,9]，在本研究中的5种抗菌素中，从对照黄颡鱼消化道中分离的菌株对氟苯尼考、甲砜霉素均比较敏感，对硫酸新霉素和盐酸多西环素的敏感程度稍逊于氟苯尼考和甲砜霉素，而对恩诺沙星的敏感程度最低。这可能是养殖业者以往预防和治疗黄颡鱼疾病过程中，使用恩诺沙星比较多的缘故。

值得注意的是，给供试黄颡鱼投喂氟苯尼考药物饵料后，黄颡鱼消化道中的细菌不仅对氟苯尼考的耐药性有所上升，而且同属于酰胺醇类抗菌药物的甲砜霉素的耐药性也相应上升了，即氟苯尼考与甲砜霉素之间显示出了明显地交叉耐药性。而测定结果也证明了分离菌株对属于氨基糖苷类的硫酸新霉素、属于四环素类的盐酸多西环素和属于喹诺酮类的恩诺沙星，均未出现明显交叉耐药性的现象。

需要说明的是，本研究中未对分离菌株做种类鉴定，而对抗菌药物的敏感性是与细菌的种类相关的[13]。试验与对照组中各种细菌种类的差异，以及因为种类差异导致的对药物敏感性测定结果的影响，尚需要进一步研究。